基因编辑获重大突破!首次实现线粒体DNA的精准编辑

来源:奇点网

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搓搓手,今天基因编辑技术又登上一个新台阶了!

这次迎来解答的是CRISPR也没搞定的历史遗留难题——对线粒体DNA的精准编辑。

今日,《自然》杂志刊登了一项新研究,科学家们利用一种细菌毒素DddA开发了针对线粒体DNA的单碱基编辑器DdCBE,可直接针对双链DNA将C-G碱基对编辑为T-A碱基对,而且编辑效率很高,也几乎没有脱靶效应。该研究通讯作者为刘如谦和Joseph D。 Mougous。

看完论文不禁感叹,这个编辑器真是精妙极了,人类的智慧牛逼(为刘老师打电话——

图源 | science.com

DddA是一种细菌毒素,最开始是通讯作者之一、微生物学家Mougous团队中一位博士后Marcos de Moraes发现的。2018年,de Moraes发现DddA具有催化胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶的活性,而且有意思的是,与其他的脱氨酶不同,这种作用可以直接在DNA双螺旋上发生,不需要解旋。

Mougous当时就想到了只闻其名未曾谋面的同事刘如谦。刘如谦团队之前开发的CRISPR单碱基编辑器中就有用到过脱氨酶,或许DddA也能够在相关的领域得到应用。

经过邮件沟通,两个团队一拍即合。

不过他们一致认为,就算用DddA再造新的CRISPR单碱基编辑器,也不会比现有的技术有太多的优势,所以研究者们一开始就瞄准了新的应用场景——线粒体DNA编辑。

对线粒体DNA的精准编辑是从来没人实现过的,现在应用最广泛的CRISPR技术面对线粒体DNA也是束手无策——线粒体没有吸收RNA的机制,所以CRISPR技术关键的gRNA根本就进不去线粒体。

那么其他的基因编辑技术呢?

2018年,《自然医学》杂志曾同期发表了两篇论文,分别利用锌指蛋白核酸酶技术(ZFNs)和转录激活样因子核酸酶技术(TALENs)实现了对线粒体DNA突变的消除。不过这两项技术能做的,是将携带突变的线粒体DNA直接降解,其实应用起来难度很大。毕竟线粒体DNA的拷贝数如果太低,也会带来疾病。

这样一看,DddA的潜力还真是挺大。它本身是个蛋白,能够进入线粒体,又可以直接对双链DNA编辑,简直非常值得研究一番。

DddA的三维构象

当然了,到这里还只是刚刚有了一个思路,其实从DddA到最终的DdCBE,要解决的问题还有三个。

第一,不管怎么说,胞苷脱氨酶对哺乳动物细胞来说是有生物毒性的。为了避免这种毒性,研究者们想出的办法是把DddA一拆两半,两个没有活性的部分在编辑位点重组恢复脱氨活性。不知道研究者们是不是从ZFN和TALEN中获得的灵感呢。

TALE能够识别特定的DNA序列,将设计好的TALE蛋白与半个DddA相连,这样DddA们就能够在编辑位点重逢了。

第二,怎么让组合好的DddA进入线粒体呢?这个问题倒是不难解决,在ZFN和TALEN中也有答案,加上线粒体靶向信号(MTS)蛋白序列,就能够利用线粒体的蛋白质吸收机制穿过线粒体的双层膜了。

第三,DddA作为一种胞苷脱氨酶,它能够做的是将胞嘧啶(C)脱氨变为尿嘧啶(U),而U是RNA碱基,出现在DNA中很容易被尿嘧啶-DNA糖基化酶切掉,又恢复成C。

为了保住DddA的作用不被干扰,还要再加上尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI),把U保住,等到下一轮DNA复制,它就可以和腺嘌呤(A)互补而不是和鸟嘌呤(G)互补。从实验数据来看,加入UGI之后编辑效率提高了8倍。

至此为止,DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器(DdCBE)才彻底完成了。简单总结一下,这个DdCBE包含四个部分:进入线粒体的向导MTS、协助识别DNA靶点的TALE蛋白、编辑主力军DddA(半个)以及UGI。

DdCBE结构

研究者尝试编辑了几个不同的线粒体基因,编辑效率大约在4.6%到49%之间,影响因素包括两个半个DddA的方向、TALE蛋白设计、两个亚基之间的间隔、靶点和TALE的相对结合位置等。

至于基因编辑中最受关注的脱靶效应,实验数据给出的结论是对细胞核基因没有脱靶,线粒体DNA脱靶效应很少,主要与TALE有关。

在HEK293T细胞中进行的实验显示,DdCBE的编辑活性能够持续18天,其间对线粒体DNA的编辑没有降低细胞存活率、没有产生大的DNA片段缺失、也没有影响DNA拷贝数。

理论上来说,DdCBE有希望解决目前一半的线粒体DNA突变,就算不能够修正全部突变,只是减少有害突变拷贝的数量,对于线粒体疾病也是能够起到治疗效果的,可以说DdCBE是线粒体疾病基因疗法的一大进步,同时也是研究线粒体基因组的有力工具。

标题名称:基因编辑获重大突破!首次实现线粒体DNA的精准编辑
文章URL:https://www.cdcxhl.com/article30/cpheso.html

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